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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2019-08-01 - 2020-09-30

Wir schlagen vor, einen Prototypaufbau für die holographische Phasenkontrast-Mikrozytometrie (HPCMC) zu bauen, eine von uns entwickelte einzigartige Methode, die Messungen von Größe, Form, optischen Eigenschaften und Bewegung von Objekten im Mikrometerbereich, z. Kolloide, Bakterien und Zellen, die in den Lebensmittel- und Biowissenschaften und verwandten Industrien untersucht wurden. Die holographische Phasenkontrast-Mikrozytometrie ist eine bahnbrechende markierungsfreie Mikroskopie- / Zytometrietechnik, die Statistiken der physikalischen Eigenschaften einzelner Mikropartikel und Mikroorganismen in Dispersion liefert. Unsere Technik basiert auf der Transmissionslichtmikroskopie. Anstatt in der Probe fokussiertes Licht zu verwenden, strahlen wir einen kollimierten Laserstrahl, ähnlich einem Laserpointer, durch die Probe. Dann zeichnen wir sogenannte Inline-Hologramme auf, die nur die Interferenz zwischen gestreutem Licht und dem Rest des Beleuchtungsstrahls darstellen. Um die Daten zu analysieren, wird das Licht „zurückgeworfen“, um das vollständige 3D-Lichtfeld zu erhalten, das sowohl Informationen zur Intensität als auch zur relativen Phase in jeder Tiefe liefert. Durch Kombinieren dieser Phasen- und Intensitätsinformationen können Phasenkontrastbilder aller Objekte in der Probe erzeugt werden. Mithilfe unserer einzigartigen und proprietären Algorithmen können wir alle Objekte in der Probe anhand der Menge des gestreuten Lichts, ihrer Form, Ausrichtung usw. charakterisieren. Darüber hinaus können wir dynamische Eigenschaften aus 3D-Trajektorien bestimmen. HPCMC kombiniert darüber hinaus diese einzigartige Charakterisierungsleistung mit einem Durchsatz, der dem der Durchflusszytometrie (FC) ähnelt. Durchflußzytometrie mißt auch Signale von einzelnen Mikropartikeln und Mikroorganismen, diese müssen jedoch vorher getrennt werden, typischerweise durch individuelle Einkapselung in Tropfen. Entscheidend für die Durchflusszytometrie ist die Markierung der Proben mit Fluoreszenzmarkern und deren Kombination mit der Analyse des vom Objekt gestreuten Lichts. Daher werden die Proben einer invasiven Voretikettierung unterzogen und es wird kein Bild erfasst. Letzteres bedeutet, dass entscheidende Eigenschaften wie Form und Größe nicht bestimmt werden können. Es werden auch keine Informationen über dynamische Informationen des Objekts erfasst, wie z. B. seine Beweglichkeit (Diffusion, Rotation, Vortrieb usw.), die wichtige Parameter in der Biowissenschaft sind, aber mit Hochdurchsatzmethoden heutzutage nicht verfügbar sind. HPCMC bietet quantitative Messungen physikalischer Eigenschaften, einschließlich der Mobilität einzelner Objekte bei hohen Erfassungsraten, und damit eine genaue Statistik der gesamten Probenpopulation mit Subpopulationsvariationen. Im Gegensatz zu bevölkerungsbasierten Methoden wie Standardstreutechniken kann HPCMC daher Datensätze verfeinern, um Teilpopulationen mit unterschiedlichen physikalischen oder beweglichen Eigenschaften innerhalb einer Bevölkerung zu identifizieren und so den Forschern und der Qualitätskontrolle neue Türen zu öffnen.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2019-01-01 - 2020-12-31

Viele Gram-positive Bakterien sind von einer zweidimensional-kristallinen Zelloberflächen (S-) Schicht, die aus selbstassemblierenden (Glyko)Proteinen besteht, bedeckt. Diese S-Schicht besitzt Periodizität im Nanometerbereich, was viele Anwendungsperspektiven in der Nanotechnologie und Biomedizin eröffnet (Sleytr, Bayley et al. 1997). Es fehlt jedoch die detaillierte Kenntnis darüber, wie die S-Schicht mit der darunter¬liegenden Peptidoglykan-Zellwand von Bakterien verbunden ist. Ausgehend von der Forschung an dem Pathogen Bacillus anthracis und dem Modellorganismus Paenibacillus alvei CCM2051T ist das meiste Wissen über die Situation in Gram-positiven Bakterien ver¬fügbar, wo sogenannte Oberflächenhomologie (SLH) Domänen als Zellwand-Targeting-Module für die S-Schicht dienen. SLH-Domänen interagieren wiederum mit einem spezies-spezifischen, Peptidoglykan-gebundenen sekundären Zellwandpolymer (SCWP), das als Zellwandligand dient (2-4). Obwohl es offensichtlich ist, dass diese Strategie zur Verankerung von Zelloberflächenproteinen interessant für eine therapeutische Interven¬tion ist, fehlt ein mechanistisches Verständnis des zugrundeliegenden Prinzips. Diese SCWPs fallen in die Kategorie der nicht-klassischen SCWPs, da sie sich strukturell von den bekannten Teichonsäuren unterscheiden (3). Das SCWP von P. alvei SCWP ist ein Polymer bestehend aus aus elf [→3)-β-D-ManpNAc-(1→4)-β-D-GlcpNAc-(1→] Disaccharideinheiten, wobei jeder β-D-ManpNAc Rest mit einem 4,6-verknüpften Pyruvatketal (2) modifiziert ist, was zum anionischen Charakter des SCWP beiträgt. Diese Pyruvylierung von β-D-ManpNAc, die auch im B. anthracis SCWP (4) an der terminalen Position vorliegt, ist wird als unver¬zichtbares und evolutonär konserviertes Epitop in für die Zelloberflächenpräsentation von SLH-Domänen enthaltenden Proteinen (SLH-Proteinen) angesehen (5-7). Die funktionelle Kopplung von SLH-Proteinen und SCWP-Pyruvylierung wird durch die Tatsache bestätigt, dass mehrere SLH-Protein-synthetisierende Bakterien mit einer Pyruvat enthaltenden Zellwand ein Ortholog des CsaB-Enzyms aufweisen, das den Transfer von Pyruvatketal auf β-D-ManNAc katalysiert(5). Angesichts der weiten Verbreitung dieses Mechanismus der Protein-Zelloberflächenpräsentation - sowohl bei pathogenen als auch bei nicht pathogenen Bakterien - ist es erstaunlich, wie wenig über die Biosynthese von pyruvylier¬ten SCWPs und den daran beteiligten Enzymen bekannt ist. In dieser Studie soll die Pyruvyltransferase CsaB von P. alvei hinsichtlich ihrer Substratspezifität, Reaktionskinetik und katalytisch relevanten Aminosäuren untersucht werden. Außerdem sollen mögliche Interaktionen mit anderen Enzymen aus dem SCWP Biosyntheselokus von P. alvei ermittelt werden. Auf diese Weise soll die Pyruvylierungs¬reaktion von SCWP als entscheidener Schritt für die Zeloberflächenpräsentation von SLH-Proteinen charakterisiert und gleichzeitig unser Verständnis der Biosynthese von SCWPs generell erweitert werden.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2018-10-01 - 2022-09-30

Fadenförmige Pilze spielen in der Natur eine bedeutende Rolle in dem sie abgestorbene pflanzliche Biomasse recyclen, und mit einer Vielzahl anderer Organismen positive und negative Beziehungen eingehen können. Für die Menschen ist auch ihre Funktion als wichtige Produzenten in der Biotechnologie. Sie ernähren sich indem sie Stoffe aus ihrer Umgebung in die Zelle aufnehmen, und benötigen daher eine große Körperoberfläche was sie durch eine lange, dünne Fadenform (sogenannte Hyphen) erzielen. Diese Körperform bringt aber auch Probleme mit sich, wie zum Beispiel erhöhte Anfälligkeit zur Austrocknung. Ein Mechanismus mit dem sich Pilze dagegen schützen, ist die Ausbildung von Proteinen, sogenannten Hydrophobinen, die die physikalischen Eigenschaften ihre Zelloberfläche je nach Anforderung verändern können. In diesem Projekt wollen wir daher untersuchen, welche biochemischen Eigenschaften der Hydrophobine für welche dieser oben angeführten chemischen, physikalischen und biologischen Anforderungen notwendig sind. Als Untersuchungsobjekt verwenden wir dazu Spezies der Pilzgattung Trichoderma, welche eine ungewöhnlich hohe Anzahl von verschiedenen Hydrophobinen besitzen. Zu diesem Zweck planen wir die Untersuchung sowohl von natürlichen als auch künstlich veränderten Hydrophobinen, sowie die Umweltbedingungen für deren Ausbildung. Unter Verwendung des mittlerweile wohlbekannten CRISPR Systems werden wir schließlich Pilzstämme generieren die ein oder mehrere dieser Hydrophobine nicht ausbilden können, und deren Lebensfähigkeit unter verschiedenen Umweltbedingungen untersuchen. Die Ergebnisse dieses Projekts sollten zu einem umfassenden Verständnis der Biochemie verschiedenster Hydrophobine führen, welches nicht nur wichtige Kenntnisse über die Biologie dieser Organismen liefern wird, sondern auch die Menschen in die Lage versetzen wird diese Information zur positiven (Biotechnologie, Planzenschutz) als auch negativen (Pflanzenschädlinge) Einflußnahme auf Pilze einzusetzen.

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