Forschung

Forschungskontext: Lytische Polysaccharid-Monooxygenasen (LPMOs) sind leistungsstarke Enzyme, die glykosidische Bindungen in Polysacchariden oxidativ spalten und so die Aktivität bekannter hydrolytischer Depolymerisationsenzyme steigern. An diesem Prozess sind molekularer Sauerstoff/Wasserstoffperoxid und ein Elektronendonor beteiligt, beispielsweise Enzyme der GMC-Oxidoreduktase-Familie (z. B. Cellobiose-Dehydrogenase), kleinmolekulare Reduktionsmittel oder photoaktive Pigmente. Clonostachys rosea (Hypocreales, Ascomycota) ist ein filamentöser Pilz, der lebende Pflanzen als Endophyt besiedelt und andere Pilze parasitiert und tötet (nekrotropher Mykoparasit). Bei der Sequenzierung der C. rosea-Genome wurde festgestellt, dass die Genfamilie, die LPMOs (AA9) kodiert, sowie die GMC-Oxidoreduktase-Familie (AA3) deutlich erweitert sind. Im Gegensatz dazu weisen die Genome der saprotrophen und mykoparasitären Trichoderma-Arten (ökologisch sehr ähnlich zu C. rosea) eine deutlich geringere Anzahl von AA9- und AA3-Genen auf. Forschungsziele: Wir wollen die katalytischen Aktivitäten und Substratspezifitäten der neuartigen LPMOs von C. rosea aufklären, neue Struktur-Funktions-Aspekte in Kombination mit biochemischen Charakterisierungen identifizieren und ihre Synergien mit anderen nativen Enzymen von C. rosea, wie z. B. GMC-Oxidoreduktasen, untersuchen.

Ein zentraler Schalter in der Giftproduktion von Schimmelpilzen. Schimmelpilze spielen auf unserem Planeten eine Vielzahl ökologischer Rollen, insbesondere in natürlichen Nährstoffkreisläufen und als Krankheitserreger von Pflanzen und Tieren. Von besonderem Interesse ist ihre Fähigkeit, eine Vielzahl kleiner, bioaktiver Moleküle zu produzieren. Ein Beispiel für ein sehr nützliches Molekül ist das Antibiotikum Penicillin, das bis heute Millionen von Leben gerettet hat. Aber es gibt auch gefährliche Moleküle, wie z. B. von Schimmelpilzen produzierte Gifte, die sich in Lebensmitteln anreichern und damit die Gesundheit der Verbraucher gefährden können. Das generelle Ziel muss also sein, die molekularen und zellulären Programme dieser Pilze genau zu verstehen und so natürliche Lösungen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln. Unsere bisherige Forschung hat gezeigt, dass epigenetische Prozesse die Toxinproduktion regulieren, aber auch eine bestimmte Kinase - ein regulatorisches Protein, das andere Proteine in seiner Umgebung chemisch verändern kann - spielt eine entscheidende Rolle. Auf bisher unbekannte Weise ist es in der Lage, in der Zelle ein Hungersignal zu senden, das letztlich zu einer vollständigen Veränderung des zellulären Stoffwechsels führt und damit die genetische Maschinerie zur Toxinbildung aktiviert. In diesem Projekt gehen wir nun der Frage nach, wie genau das Hungersignal in der Pilzzelle verarbeitet wird, damit Mykotoxine gebildet werden. Dazu verwenden wir als Versuchssysteme einen herkömmlichen Schimmelpilz, der in der Natur und in Gebäuden ubiquitär vorkommt (Aspergillus), und einen Pilz, der weltweit als einer der wichtigsten Krankheitserreger bei Nutzpflanzen gilt (Fusarium). Die gesamte genetische Reaktion der beiden Pilze auf RNA- und Proteinebene wird in verschiedenen Stadien ihres Lebenszyklus molekularbiologisch, biochemisch und bioinformatisch analysiert. Darüber hinaus sollen diejenigen Proteine identifiziert werden, deren Funktion durch die Kinase reguliert wird. Auf diese Weise soll der Signalweg vom Nährstoffmangel an der Zelloberfläche bis zur genetischen Aktivierung der Toxinproduktion bei zwei verschiedenen Schimmelpilzen möglichst vollständig aufgeklärt werden. Letztlich könnten die Ergebnisse dieser Forschung eine Lücke im grundlegenden Verständnis der zellulären Prozesse bei der Toxinproduktion in Schimmelpilzen schließen. Dieses Wissen kann dann für die Entwicklung neuer natürlicher Bekämpfungsstrategien zur Abwehr von Pflanzenkrankheiten und zur Vermeidung biologischer Kontaminationen von Lebensmitteln genutzt werden.

In Verbindung mit der groß angelegten Genomsequenzierung von Pilzen und Oomyceten bieten diese Entdeckungen neue technische Mittel für sogenannte „Genom Mining“-Kampagnen bei Pilzen, die eine wesentlich bessere Nutzung der großen chemischen Vielfalt von Pilzen ermöglichen würden. In diesem translationalen Wissenschaftsprojekt schlagen wir vor, dieses Grundlagenwissen für die Entdeckung neuer natürlicher bioaktiver Substanzen aus dem verborgenen chemischen Raum der Pilze zu nutzen. Aus früheren Screenings in kleinem Maßstab und zusätzlichen vorläufigen Daten haben wir bereits einen soliden Konzeptnachweis erbracht, dass mit dieser Strategie viele neue Moleküle gefunden werden können. Wir schlagen hier vor, systematisch chromatin-modifizierende Methoden einzusetzen und unsere große und vielfältige eigene Stammsammlung in einem Hochdurchsatz-Screening-Format (HTP) zu nutzen. Die Techniken und die Infrastruktur für ein derartiges Projekt sind an unserem Institut und der assoziierten BMOSA Core-Facility (https://boku.ac.at/cf/bmosa) verfügbar. Mit diesem HTP-Ansatz werden wir die stillgelegten Bereiche in den Genomen von Tausenden verschiedener Pilze aus etwa 400 verschiedenen Gattungen aktivieren. Für jedes Pilzisolat werden wir insgesamt mindestens sieben verschiedene "Aktivierungs-Strategien“ zur Öffnung des Chromatins anwenden, von denen vier völlig neu sind, aber trotzdem bereits unveröffentlichte Konzeptnachweise aus unserem Labor zur Verfügung stehen. Wir werden gezielt nach Substanzen suchen, die das Wachstum von Ascomyceten oder Oomyceten unterdrücken oder eine zurückdrängende oder tödliche Wirkung auf Nematoden und Insekten haben. In diesem Bereich gibt es eine enge Kooperation mit dem beteiligten Industrieunternehmen. Bereits zu Projektbeginn steht die komplette Pipeline von der HTP-Stammkultivierung und Aktivitäts-Bioassays für Pilze und Oomyzeten zur Verfügung. Neuartige HTP-Formate werden im Rahmen dieses Projekts als zusätzlicher innovativer Aspekt implementiert. Die chemische Isolierung und Charakterisierung der aktiven Moleküle bis hin zu deren Toxizitätstests und Studien zur Wirkungsweise werden dann ebenfalls in unseren Labors durchgeführt. Wir gehen davon aus, dass wir mit diesem Ansatz auf jeden Fall neue wissenschaftliche Grundlagen erforschen, um die Regulierung der pilzlichen Sekundärstoffproduktion besser zu verstehen. Der Hauptnutzen wird jedoch die Entdeckung einer Vielzahl neuartiger natürlicher bioaktiver Substanzen sein, die in Zukunft von dem teilnehmenden Unternehmenspartner zu spezifischen und sicheren Naturstoffen gegen landwirtschaftliche Krankheitserreger und Schädlinge weiterentwickelt werden können.