Forschung

Trastuzumab (Tz) ist das erste von der FDA zugelassene Therapeutikum zur Behandlung von ErbB2+-Magenkrebs (GC). ErbB2 durchläuft eine umfangreiche Glykosylierung, die die Dynamik und Aktivierung der Rezeptorzellen streng kontrolliert. Auch die krebsassoziierte Glykosylierung (TACAs) an der ErbB2-Tz-Bindungsdomäne treibt die Resistenz von GC-Zellen gegen die Tz-Zytotoxizität aktiv voran, was ihre klinische Wirksamkeit untergräbt. Bisher hat die strukturelle Heterogenität von ErbB2-Glykanen die eindeutige Identifizierung und Validierung von Tz-sensitiven/resistenten TACAs und die klinische Implementierung von glykansensitiven Biomarkern für die prognostische und therapeutische Stratifizierung von ErbB2+GC-Patienten behindert. Daher bedarf die Rolle, die spezifische ErbB2-TACAs bei der erworbenen Tz-Resistenz spielen, einer weiteren Klärung. Dies wurde durch mehrere biotechnologische Hürden aufgehalten, darunter die effiziente Synthese von maßgeschneiderten Glykokonjugaten.Pflanzen eignen sich gut für die vorübergehende Expression von Glykoproteinen, ohne dass eine genetische Transformation erforderlich ist. In Bezug auf die Glykosylierung bieten Pflanzen den Vorteil eines begrenzten N-Glykan-Prozessierungsrepertoires, was eine flexible schrittweise Überexpression von Glykosyltransferasen ermöglicht, die für die Anpassung der Glykane erforderlich sind. Unser Ziel ist es aufzuklären, wie unterschiedliche ErbB2-Glykane die Bindungsaffinität und -funktion von Tz beeinflussen, um sie so als molekulare Gatekeeper des therapeutischen Ansprechens von Tz in ErbB2+ GC zu validieren. Wir stellen die Hypothese auf, dass pflanzliche "synthetische Glykane" genutzt werden können, um den ErbB2-Zuckercode zu knacken, der molekularen Prozessen zugrunde liegt, die zur GC-Therapieresistenz führen. Wir werden die Toleranz der Pflanzen gegenüber Glykoengineering nutzen, um ErbB2 herzustellen, das GC-Glykosignaturen nachahmt, und Tz-sensitive/resistente ErbB2-Glykoformen zu identifizieren.

Die Hemicellulose Xylan ist sowohl in primären als auch sekundären Zellwänden vorhanden und ist das wichtigste nicht-zellulosehaltige Polysaccharid in industriell wichtiger Biomasse wie Holz und Gräsern. Trotz der zentralen Rolle der Xylane für die Entwicklung, das Wachstum, die Festigkeit der Zellwände und der Widerstandsfähigkeit der Biomasse wissen wir immer noch sehr wenig über die Organisation und Verteilung der Xylan-Biosyntheseproteine im Golgi-Apparat und wie diese Faktoren die Biosynthese von Xylan und der Zellwand beeinflussen. Um diese Lücke zu schließen, haben wir Arabidopsis thaliana IRREGULAR XYLEM 9 (AtIRX9), AtIRX10, und AtIRX14 kloniert, die an der Synthese des Xylan-Backbones beteiligt sind. Transiente Expression von fluoreszierenden Proteinfusionen in Nicotiana benthamiana zeigte, dass nur die gleichzeitige Expression von AtIRX9, AtIRX10 und AtIRX14 zu eine robuste und effiziente Golgi-Lokalisierung bewirkt, und Co-Immunopräzipitationsexperimente zeigten eindeutig Wechselwirkungen zwischen den drei Proteinen, was auf die Bildung eines heterotrimeren Proteinkomplexes hinweist. Wir stellen die Hypothese auf, dass die Funktion der Xylan-Biosyntheseenzyme durch Protein-Protein-Interaktionen und unterschiedliche intra-Golgi-Lokalisationen reguliert wird. Wir vermuten außerdem, dass AtIRX9, AtIRX10 und AtIRX14 Teil eines größeren Multiprotein Xylan-Synthase-Komplexes im Golgi sind, der aus Proteinen mit unterschiedlichen Funktionen in der Xylan-Biosynthese besteht. Ziel dieses Projekts ist es, (1) die molekularen und mechanistischen Determinanten zu identifizieren, die für die Lokalisierung von AtIRX9/10/14 im Golgi und die Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen verantwortlich sind, (2) die Auswirkungen einer Modulation der Lokalisierung im Golgi und Protein-Protein-Wechselwirkungen auf die Xylan-Biosynthese und Zellwandzusammensetzung in transgenen Arabidopsis-Irx-Mutanten zu untersuchen und (3) die Identifizierung des Interaktoms des Arabidopsis-Xylan-Synthase-Komplexes in planta. Das Ziel ist es, Mittel zu finden, um die Xylan-Biosynthese und die Zellwandzusammensetzung im Modellorganismus A. thaliana zu modulieren.

With the aging population diseases connected to neurodegeneration are increasing. Thus, the development of effective substances for their prevention and treatment is of utmost priority. However most recently developed medically interesting products, like monoclonal antibodies (mAbs), lack or exhibit poor central nervous system (CNS) penetration. This makes its application difficult. The aim of this proposal is to modulate the biological activity of therapeutically interesting products to efficiently cross the brain-blood-barrier (BBB). An approach that neuroinvasive bacteria use to evade the human immune system and cross the BBB, will be applied. This is achieved by certain sugar polymers, so called polysialic acid (polySia), which forms large negatively-charged hydrodynamic volumes thereby altering bio- chemical, -physical properties of target products. It is hypothesized that target molecules that form micelles (or nano-particle-like structures) and carry polySia with a controlled length, so called low molecular weight (LMW) polySia, are especially effective to cross BBB. To reach the aim a two-tier strategy is applied using a therapeutic monoclonal IgG antibody (mAb) for Alzheimer Disease treatment and the sustainable expression host Nioctiana benthamiana as models. (i) Transfer the LMW-polySia pathway into Nioctiana benthamiana. The approach is based on extensive cross phylum genetics which refers to the transfer of genetic information and the molecular interactions thereof between organisms with large evolutionarily distance. In silico studies suggests that by the co-expression of genetic elements that originate from bacteria, lower and higher eukaryotes in plants allows the assembly of the LMW polySia pathway. (ii) Engineering of mAbs: mAbs are glycoproteins with a single conserved glycosylation site. To design mAbs with altered BBB features two modifications are envisaged (a) enhancing overall glycosylation content by the generation of additional glycosites and (b) design for multimeric IgG formation, to form nanoparticle-like structures. Merging (i) and (ii): Recombinant expression of mutated mAbs in glycoengineered plants. It is expected that recombinant mAbs will carry LMW polySia and form nano-particle-like structures, thereby exhibit efficient CNS penetration. Collectively, by extensive protein and cell engineering products with novel features are generated. The approach may serve as model for other products that need to be delivered to the CNS and generally boosts the engineering of “designer cells” with specified features.