Forschung

With the aging population diseases connected to neurodegeneration are increasing. Thus, the development of effective substances for their prevention and treatment is of utmost priority. However most recently developed medically interesting products, like monoclonal antibodies (mAbs), lack or exhibit poor central nervous system (CNS) penetration. This makes its application difficult. The aim of this proposal is to modulate the biological activity of therapeutically interesting products to efficiently cross the brain-blood-barrier (BBB). An approach that neuroinvasive bacteria use to evade the human immune system and cross the BBB, will be applied. This is achieved by certain sugar polymers, so called polysialic acid (polySia), which forms large negatively-charged hydrodynamic volumes thereby altering bio- chemical, -physical properties of target products. It is hypothesized that target molecules that form micelles (or nano-particle-like structures) and carry polySia with a controlled length, so called low molecular weight (LMW) polySia, are especially effective to cross BBB. To reach the aim a two-tier strategy is applied using a therapeutic monoclonal IgG antibody (mAb) for Alzheimer Disease treatment and the sustainable expression host Nioctiana benthamiana as models. (i) Transfer the LMW-polySia pathway into Nioctiana benthamiana. The approach is based on extensive cross phylum genetics which refers to the transfer of genetic information and the molecular interactions thereof between organisms with large evolutionarily distance. In silico studies suggests that by the co-expression of genetic elements that originate from bacteria, lower and higher eukaryotes in plants allows the assembly of the LMW polySia pathway. (ii) Engineering of mAbs: mAbs are glycoproteins with a single conserved glycosylation site. To design mAbs with altered BBB features two modifications are envisaged (a) enhancing overall glycosylation content by the generation of additional glycosites and (b) design for multimeric IgG formation, to form nanoparticle-like structures. Merging (i) and (ii): Recombinant expression of mutated mAbs in glycoengineered plants. It is expected that recombinant mAbs will carry LMW polySia and form nano-particle-like structures, thereby exhibit efficient CNS penetration. Collectively, by extensive protein and cell engineering products with novel features are generated. The approach may serve as model for other products that need to be delivered to the CNS and generally boosts the engineering of “designer cells” with specified features.

Breiterer Forschungskontext: Sekretorisches IgA (SIgA) hat sich aufgrund seiner einzigartigen strukturellen Merkmale, einschließlich erhöhter Pathogenneutralisierungseffizienz, entzündungshemmender Eigenschaften und verbesserter Stabilität in mukosalen Sekreten, als vielversprechender Kandidat für therapeutische Interventionen herausgestellt. Seine Interaktion mit kommensalen Bakterien und mukosalen Komponenten eröffnet einen innovativen Weg für neuartige therapeutische Anwendungen. Ein entscheidender Faktor für die einzigartigen Eigenschaften von SIgA ist seine umfangreiche Glykosylierung, doch das Glykosylierungsprofil in verschiedenen Geweben und seine biologische Bedeutung sind weitgehend unerforscht. Hypothesen: Wir vermuten, dass spezifische Glykankomodifikationen auf SIgA funktional entscheidend für die Interaktionen mit Komponenten der Mukosa, kommensalen Bakterien und Rezeptoren der Wirtszellen sind. Wir streben an, die Wissenslücke über die Glykosylierung von menschlichem SIgA durch eine umfassende Analyse der SIgA-Glykanprofile in verschiedenen menschlichen Geweben zu schließen und anschließend glykotechnische Ansätze auf rekombinantem SIgA zu verwenden, um Struktur-Funktions-Beziehungen unterschiedlicher Glykotypen zu klären. Ansatz: Wir werden die ortsspezifischen Glykosylierungsprofile auf menschlichem SIgA, das aus verschiedenen Geweben isoliert wurde, aufklären. Auf dieser Basis werden wir Glykotechnologie-Tools in der pflanzenbasierten transienten Produktionsplattform Nicotiana benthamiana einsetzen, einem bewährten und hoch geeigneten System zur effizienten Herstellung dieses komplexen und multimeren Proteins mit maßgeschneiderten N- und O-Glykanen. Die erzeugten rekombinanten SIgA-Glykotypen werden einer umfangreichen biochemischen und biophysikalischen Charakterisierung sowie in vitro- und zellbasierten Bindungs-, Aktivierungs- und proteolytischen Stabilitätsassays in mukosalen Flüssigkeiten unterzogen, um die Bedeutung der SIgA-Glykosylierung für die mukosale Immunität und die therapeutische Entwicklung zu beleuchten. Innovation: Dieses Projekt nutzt innovativ die pflanzenbasierte transiente Produktionsplattform in Nicotiana benthamiana zur Glykotechnik und ermöglicht die Produktion von vollständig assembliertem und funktionalem SIgA mit maßgeschneiderten N- und O-Glykanen. Dieser Ansatz unterscheidet sich von früheren Studien, die auf heterogene Glykosylierungsprofile angewiesen waren. Die Fähigkeit, große Mengen rekombinanten menschlichen SIgA mit homogenen Glykotypen zu produzieren, ermöglicht beispiellose Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehungen von SIgA und fördert sein Potenzial für therapeutische Anwendungen. Involvierte Wissenschaftler: Kathrin Göritzer, basierend an der BOKU Wien als Postdoktorandin (FWF Schrödinger-Stipendium), hat Expertise in der Protein- und Glykotechnologie therapeutischer Antikörper und eine umfassende Ausbildung in Immunologie absolviert. Julian Ma, basierend an der St. George’s University of London, ist ein international renommierter Pflanzenbiotechnologe und Immunologe.

Alle lebenden Zellen sind mit Glykanen ausgestattet, die an einer Vielzahl wesentlicher Zellfunktionen beteiligt sind. Säugetiere tragen auf Glykanen von Glykoproteinen und Glykolipiden am Ende üblicherweise die Sialinsäure Neu5Ac, ein negativ geladener Zucker mit neun Kohlenstoffatomen. Im Gegensatz zu Neu5Ac sind die biologischen Funktionen und immunogenen Profile einer desaminierten Sialinsäurevariante namens KDN unbekannt. Die einzigartigen Eigenschaften von KDN sind (i) Resistenz gegen Sialidase-Aktivität, (ii) Beendigung der Polysialinsäure-Kettenlänge, (iii) potenzieller natürlicher Lockvogel gegen Mikroorganismen, die Glykokonjugate mit Neu5Ac nutzen, und (iv) Antigenmarker bei verschiedenen Krebsarten. Die einzigartigen Merkmale von KDN und der Mangel an Wissen über die biologischen Funktionen tragen zur Bedeutung der vorgeschlagenen Forschung bei. Die übergeordneten Ziele des Antrags bestehen darin, KDNylierte Glykanstrukturen zu erzeugen und die strukturellen und funktionellen Auswirkungen auf ausgewählte menschliche Glykoproteine aufzuklären. Wir gehen davon aus, dass die koordinierte Expression von fünf nicht-pflanzlichen Enzymen verschiedener Arten zur Bildung rekombinanter Glykoproteine mit KDNylierten N-Glykanen führt, die möglicherweise neuartige biologische Funktionen haben. Um die biologische Funktion KDN-haltiger Glykoproteine zu erforschen, muss der KDN-Biosyntheseweg in einem geeigneten Wirtssystem konstruiert werden. Die transiente Expression in Pflanzen ist ein etablierter Ansatz für Glycoengineering und rekombinante Proteinproduktion und Pflanzen sind gut geeignet, da ihnen der störende Neu5Ac-Sialinsäure-Biosyntheseweg fehlt. Der Biosyntheseweg von KDN wird durch eine transiente Expressionsmethode über Agroinfiltration eingeführt. Um die Expression und Aktivität zu optimieren, wird eine Reihe von Expressionskonstrukten generiert, die unterschiedliche Kombinationen von Promotor-Terminator- und subzellulären Lokalisierungssignalen tragen, und zur Produktion von freiem KDN, CMP-KDN und KDN-haltigen N-Glykanen verwendet. Die resultierenden Produkte werden mittels HPLC und Massenspektrometrie analysiert. In-vitro-Bindungstests werden durchgeführt, um die Rolle von KDN auf IgG1-N-Glykanen bei der Fcγ-Rezeptor-Interaktion zu untersuchen, und in-vivo-Experimente werden durchgeführt, um das pharmakokinetische Profil von KDNylierten Glykoproteinen zu untersuchen. In Säugetierzellen überlappen sich die Biosynthesewege von CMP-Neu5Ac und CMP-KDN auf verschiedenen Ebenen. Daher verhindert das Vorhandensein eines nativen Sialinsäurewegs die Bildung homogener KDNylierter Glykoproteine. Pflanzen produzieren komplexe N-Glykane, verfügen jedoch nicht über einen Sialinsäureweg. Die heterologe Expression des KDN-Biosynthesewegs wird es erstmals ermöglichen, KDNylierte Glykoproteine mit hoher Homogenität zu produzieren und deren funktionelle und biochemische Eigenschaften zu untersuchen.