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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2020-11-02 - 2023-11-01

Human heme peroxidases figure prominently in human biology by contributing to tissue development and architecture, thyroid hormone biosynthesis and innate immunity. Myeloperoxidase (MPO), eosinophil peroxidase (EPO) and lactoperoxidase (LPO) exhibit an indispensable role in microbial killing by releasing potent antimicrobial oxidants. However, these reaction products may also adversely affect tissues and cause acute and chronic inflammatory diseases. Consequently, there is a need for highly selective inhibitors for MPO, EPO and LPO with no risk of off-target effects, i.e. interference with thyroid peroxidase and peroxidasin 1, which share a similar heme cavity architecture. It has been found that pathogenic bacteria like Staphylococcus aureus have evolved a broad repertoire of strategies to resist microbial killing including SPIN (Staphylococcal Peroxidase INhibitor) that binds tightly to MPO and inhibits its enzymatic activity. SPIN shares no sequence homology to other known proteins and consists of two functionally distinct domains, i.e. a small N-terminal domain which acts as a molecular plug of the access channel and a C-terminal domain which mediates the specific binding to human MPO. This project will characterize the structural basis as well as the thermodynamics and kinetics of binding of SPIN-aureus to and inhibition of MPO including its interference with the individual reaction steps in the halogenation and peroxidase cycle of MPO. We further aim to understand the structure and function of recently identified SPIN-aureus homologs from other staphylococcal species and of an artificially designed SPIN-consensus protein that binds to both MPO and EPO. These investigations will include both comprehensive biochemical and biophysical investigations as well as molecular dynamics simulations. These studies will provide the basis for the design of specific binders and inhibitors for human peroxidases. In detail, we aim to design specific inhibitors for MPO, EPO and LPO employing (i) a rational design including saturation mutagenesis and chemical engineering of the N-terminal plug and (ii) directed evolution of the binding domain for specific interaction with MPO, EPO and LPO using yeast surface display combined with fluorescence activated cell sorting of newly generated SPIN libraries. Summing up, this project will provide (i) the fundamental biochemical understanding of the interaction of SPIN proteins with the human heme peroxidases as well as (ii) will design and select SPIN-based inhibitors of MPO, EPO and LPO. Future studies will focus on the application and further development of these lead candidates as potential drugs in in vitro and in vivo studies.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2021-01-01 - 2023-12-31

Breiterer Forschungskontext / theoretischer Rahmen: Glykane bedecken die Oberflächen aller Zellen und sind je nach Art und Phyla unterschiedlich. Hypothesen/Forschungsfragen/Ziele: Basierend auf früheren Arbeiten von uns und anderen, sind die wichtigsten zugrunde liegenden Hypothesen (i) anionische/zwitterionische Modifikationen von N-Glykanen variieren zwischen Ordnungen und Arten von Arthropoden, und diese Strukturen sind entweder (ii) durch Säugetier-Immunlektine gebunden, die z.B. an der Erkennung von von Arthropoden stammenden Viren beteiligt sind, (iii) an Interaktionen von Pathogenen mit Arthropoden (z.B. Stechmücken) als Zwischen- oder Endwirte beteiligt oder (iv) haben eine angeborene Funktion, z.B. bei der Entwicklung der Arthropodenart selbst. Ansatz/Methoden Enzymatische Remodellierung von Sacchariden, Präparation/Analyse natürlicher Glykane aus ausgewählten Insekten und Sondierung von Sacchariden/Glykanen in einem Microarray-Format mit Lektinen, Pentraxinen und Antikörpern. Grad der Originalität / Innovation Das Projekt hat das Ziel, neue Informationen über die Glykosylierung von Insekten zu liefern.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2020-07-01 - 2023-06-30

Theoretischer Rahmen: Die prokaryotische Häm-Biosynthese wurde über mehrere Jahrzehnte ausführlich untersucht. Im Jahr 2015 kam dieses Thema durch die Entdeckung des sogenannten "Coproporphyrin-abhängigen" (CPD) Häm-Biosynthesewegs durch Dailey und Mitarbeiter wieder in den Fokus, der hauptsächlich von grampositiven Bakterien genutzt wird. Der CPD-Syntheseweg unterscheidet sich vom Protoporphyrin-abhängigen Weg durch die Sequenz der Uroporphyrinogen-zu-Häm b-Transformation und die beteiligten Enzyme (UroD, CgoX, CpfC ChdC). Studien zu CpfC wurden bis vor kurzem unter Verwendung von Protoporphyrin IX anstelle von Coproporphyrin III durchgeführt. Zielsetzungen: Zuverlässige Kenntnisse über die Biochemie und molekulare Enzymologie von CpfCs sind sehr begrenzt. Unser Ziel ist die Untersuchung der Proteinbiochemie und die Aufklärung der enzymatischen Mechanismen der Coproporphyrin-Ferrochelatasen aus (i) Firmicutes und (ii) Actinobakterien, um den Mechanismus der Katalyse zu verstehen, einschließlich der Substratbindung beider Substrate und der enzymatischen Insertion von Eisen(II)-Eisen in Coproporphyrin III. Methoden: Die biochemische und biophysikalische Charakterisierung der Coproporphyrin-Ferrochelatasen (CpfCs) wird unter Verwendung mehrerer spektroskopischer High-End-Methoden und einer stationären und prästationären kinetischen Charakterisierung von Wildtyp- und mutierten Enzymen durchgeführt. Darüber hinaus werden wir modernste strukturbiologische Methoden anwenden, um profunde Kenntnisse über die Struktur des Enzyms bis ins kleinste Detail zu gewinnen, wie z.B. Protonierungszustände (durch Neutronenkristallographie). Innovation: Der CPD-Häm-Biosyntheseweg wurde kürzlich in der Literatur beschrieben, und viele Fragen zu den Mechanismen und Wechselwirkungen der Enzyme sind noch unbeantwortet. Er ist essentiell für grampositive Bakterien und einige wenige intermediäre und gramnegative Bakterien. Das Verständnis der Biochemie der beteiligten Enzyme, mit Schwerpunkt auf CpfCs, und der allgemeinen Regulation der Häm-Biosynthese, der Aufnahme und des Abbaus dieser Bakterien ist eine sehr wichtige Frage der Grundlagenforschung. Dieses Projekt wird eine solide Grundlage für die zukünftige Entwicklung neuer Therapeutika gegen pathogene grampositive Bakterien schaffen.

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