Forschung

Rezeptoraffinität und Wirtsspektrum von AIVs des Subtyps H16 Research context Interspecies transmission of influenza viruses may require viral adaptation to cellular sialic acid (Sia)-containing receptors in the target tissues of a new host. Some subtypes of avian influenza viruses (AIVs), such as H5, are able to propagate in a wide range of hosts, while other subtypes, such as H16 (and to a lesser extent H13), have only been isolated from a narrow range of gull species. Hosts also have different levels of susceptibility to AIVs. Some species of wild birds, such as ducks, have been infected with nearly every subtype of AIV (except H16), while some species, such as gulls, are considered as exclusive reservoirs of the H16 subtype. The structure of the receptor binding domain of the AIV hemagglutinin protein and the cellular receptors of hosts are probably instrumental in the virus-host attachment and infection process. We hypothesize that: 1) the HA protein of H16 subtype AIVs has a unique 3D structure that restricts the viruses to a limited range of cell receptors, 2) gull species become more infected with H16 (and H13) subtype AIVs due to the presence of specific types of receptors on the surface of their respiratory and intestinal cells (which are different from the common receptors that are abundant in duck species) and 3) H16 subtype AIVs can propagate more efficiently in gull tissues and gull-derived cells than in duck tissues and duck-derived cells. Our approach: 1) At AIV level: We will study a wide range of H16, H13 and H5 AIVs, their hemagglutinin sequences and 3D structures and their affinity to a range of glycans using sialylglycopolymers and glycan microarray chips to correlate virus structural and genetic properties to glycan (indirectly representing receptor) affinity. 2) At cell and tissue level: We will study the distribution of Sia receptors in the intestine/respiratory tissues and cell cultures of duck and gulls using single specific lectins and lectin microarray chips. We will study the expression of the genes of the enzymes that produce Sias in the cells as an indirect indicator of the presence of the receptors. The results will provide a tool to evaluate any bird species as a potential host for H16 AIVs. 3) At AIV-host interaction level: We will study the affinity of FITC-labeled AIVs to tissue sections; and the replication rate of AIVs by cultivating a variety of H16 and H13 viruses in duck-/gull-derived cell lines; and we will perform animal experiments using selected H16 AIVs and bird species. This will enable us to validate the in vitro and in vivo results in a real virus-host replication and interaction study. Level of originality Our study is novel in that it incorporates a range of conventional and modern techniques to address an important yet neglected question about the role of receptors in the susceptibility of wild birds to infection with two groups of AIVs.

Glykane bedecken die Oberflächen aller Zellen und werden durch spezifische biochemische Wege in intrazellulären Kompartimenten, bekannt als endoplasmatisches Retikulum und Golgi-Apparat, biosynthetisiert, bevor sie zur Zelloberfläche transportiert werden. Genetische Defekte im Transport zwischen und innerhalb dieser Kompartimente führen zu veränderter Zelloberflächenglykosylierung, was häufig neurologische und andere Phänotypen bei menschlichen Patienten verursacht. In diesem Projekt werden wir Transportmechanismen in dem Modellnematoden (Caenorhabditis elegans) also auch in Insektenzelllinien untersuchen. Generierte mutierte Stämme werden im Hinblick auf veränderte Glykosylierung und geänderte Lokalisierung wichtiger biosynthetischer Enzyme mit modernen massenspektrometrischen, arraybasierten und mikroskopischen Methoden untersucht; besonders das Verhalten der Mutanten-Nematoden wird mit einem Hochdurchsatz-Videosystem analysiert. Insbesondere die Daten von C. elegans werden ein grundlegendes Verständnis des intrazellulären Transports im Hinblick auf menschliche Krankheiten liefern.

Humanes Peroxidasin 1 (PXDN) ist ein Multidomänenprotein, das eine entscheidende Rolle bei der Stabilisierung hochspezialisierter Basalmembranen spielt. Es katalysiert die Oxidation von Bromid zu hypobromiger Säure, welche wiederum die Bildung einer einzigartigen kovalenten Sulfilimin-Bindung innerhalb des Kollagen-IV-Netzwerks fördert. Diese seltene Vernetzung erhöht nicht nur die mechanische Festigkeit der Basalmembran, sondern unterstützt auch ihre Funktion als Gerüst für Zelladhäsion und -signalisierung. Trotz seiner biologischen Bedeutung sind die strukturelle Organisation und die spezifischen Funktionen mehrerer für Peroxidasin typischer Domänen – wie der leucin-reichen Repeat-Domäne (LRR), der Immunglobulin-Domänen (Ig) sowie des C-terminalen von-Willebrand-Faktor-Typ-C-Moduls (vWFC) – bislang nur unzureichend verstanden. Es wird angenommen, dass diese Domänen an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind und zur Zelladhäsion beitragen, ihre genauen Funktionen sind jedoch noch nicht geklärt. Ziel 1 dieses Projekts ist es, zu untersuchen, ob Peroxidasin – oder einzelne Konstrukte seiner Domänen – direkt oder indirekt mit anderen Komponenten der Basalmembran interagiert. Die bislang begrenzten strukturellen Daten zu PXDN stellen jedoch ein wesentliches Hindernis für das Verständnis der räumlichen Anordnung seiner Domänen und der Auswirkungen umfangreicher posttranslationaler Modifikationen – wie Glykosylierung und Häm-Einbau – dar. Um die Interaktionen mit extrazellulären Matrixkomponenten zu charakterisieren, werden Bindungsstudien mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) durchgeführt. Zur Schließung dieser Wissenslücke besteht Ziel 2 darin, die dreidimensionale Struktur des voll-längen Peroxidasins in Anwesenheit synthetischer und/oder physiologischer Bindungspartner zu bestimmen. Die Strukturanalyse erfolgt mittels Röntgenkristallographie und Kryo-Elektronenmikroskopie (cryo-EM). Eine zentrale Innovationskomponente des Projekts ist der Einsatz von verkürzten PXDN-Konstrukten für domänenspezifische Bindungsexperimente. Auf diese Weise kann ermittelt werden, welche Domänen für die Interaktion mit bestimmten Basalmembranmolekülen verantwortlich sind. Parallel dazu liefert die Br-Tyrosin-Peptid-Mapping-Analyse mittels Massenspektrometrie ergänzende Informationen zur Bindungsoberfläche. Die Auflösung der Struktur des vollständigen Peroxidasins mittels Kryo-EM wird letztlich neuartige Einblicke in die Dynamik der Domäneninteraktionen und intermolekularen Bindungen ermöglichen. Die Arbeiten erfolgen in enger Zusammenarbeit mit Prof. Kristina Djinović-Carugo vom Europäischen Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) in Grenoble als internationaler Partner.