Forschung

Metabolischer Abbau von methylierten Glykanen

Die Methylierung von Biomolkülen ist in viele zelluläre Regulationsprozesse involivert. Für Proteine und DNA-Moleküle sind bereits einige diesbezügliche Auf- bzw. Abbauwege bekannt. Allerdings wurden Methylgruppen auch auf Kohlenhydratstrukturen gefunden und für diese gibt es noch keine Informationen bezüglich Biosynthese oder Abbau. Kohlenhydratstrukturen spielen eine wichtige Rolle bei Erkennungsprozessen. Eine Modifikation der einzelnen Zuckereinheiten verändert die Spezifität von Erkennungs- und Bindungsvorgängen.  

Hypothesen/Ziele:

Im vorliegenden Projekt möchten wir den Abbau von methylierten Glykanstrukturen untersuchen. Jene Organismen, die in der Lage sind solche Strukturen zu (bio)synthetisieren, müssen auch einen entsprechenden Mechanismus für deren Abbau aufweisen.

In Schneckengeweben wurden Methylgruppen an protein-gebundenen Glykanstrukturen nachgewiesen. Daher werden in diesen Organismen auch Enzyme erwartet, die diese Strukturen metabolisch abbauen können.

Ansatz/Methoden:

Eine solche Demethylierungs-Enzymaktivität wird im Rahmen des Projekts mittels nativen und synthetischen  Substraten in Schneckenorganellen nachgewiesen. Danach werden Proteine, die die entsprechende Enzymaktivität aufweisen, gereinigt, sequenziert, kloniert und exprimiert. Sowohl das native als auch das rekombinante Protein werden auf ihre biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften untersucht. Die Substratspezifitäten werden mit verschiedenen nativen Substraten und anderen methylierten Molekülen ermittelt um einen Überblick für potentielle Anwendungen zu erhalten. Mittels der Aminosäuresequenz wird in Datenbanken nach homologen Proteinen anderer Organismen, die bekannterweise auch methylierte Zuckerketten aufweisen (andere Mollusken und Parasiten), gesucht.

Beginn: März 2020

Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter an diesem Projekt:

Julia Thoma, MSc.
Dissertation

Dipl.-Ing. Marilica Zemkollari
Dissertation

Annalena Gamperl - Masterarbeit 2022

Es ergeben sich laufend Fragestellungen im Rahmen des Projekts, die für Diplom/Masterarbeiten geeignet sind. Bei Interesse bitte fragen !
 

Finanzierung

FWF P 33239-B (02/2020 - 01/2024)

Kooperationspartnerin

Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. Reingard Grabherr
Department für Biotechnologie, BOKU

Klonierung und Charakterisierung von Glykosyltransferasen aus Schnecken

Glykosylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, die im korrekten Transport der Proteine, ihrer Funktion und in diversen Erkennungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Da Schnecken in einigen Fällen die Zwischenwirte für Parasiten sind, ist die Untersuchung der in diesem Zusammenhang stehenden Erkennungs- und Bindungsprozessen die auf Glykanen basieren, ein spannender Forschungsbereich.

Enzyme, die an der Biosynthese dieser Glykane beteiligt sind, stellen eine interessante Ressource zur Modifikation von artifiziellen Oligosacchariden dar. Über Enzyme aus Gatropoden ist bisher nur sehr wenig bekannt. Das wollen wir nun ändern ! Im Rahmen des Projekts sollen verschiedene Fukosyltransferasen und eine Xylosyltransferase gereinigt, kloniert und charakterisiert werden. 

Die biochemischen Teile der Arbeit werden am Department für Chemie, Arbeitsgruppe Glykobiologie unter meiner Betreuung durchgeführt. Die molekularbiologischen Arbeiten werden von Prof. Reingard Grabherr am Department für Biotechnologie betreut.

Methodik: Biochemische (Proteinreinigung, Enzymaktivitätsbestimmung, Charakterisierung) und molekularbiologische Arbeitsmethoden (cDNA-library, Zellkultur, Klonierung, Expression)

Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter an diesem Projekt:

Chantal Lucini
Dissertation 2014

Christopher Taus
Dissertation 2013

Teresa Riegler
Diplomarbeit 2010

Marita Preims
Diplomarbeit 2013

Finanzierung

FWF P22118-B20 (04/2010 - 03/2015)

Kooperationspartner

Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. Reingard Grabherr
Department für Biotechnologie, BOKU

Univ. Prof. Dr. Kiyoshi Furukawa
Nagaoka University of Technology, Nagaoka, Japan

O-Glykane in Gastropoden

O-Glykosylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, die im korrekten Transport der Proteine, ihrer Funktion und in diversen Erkennungsprozessen eine wichtige Rolle spielt (z.B. Parasit - Zwischenwirt). Im Bereich der Nicht-Säuger gibt es nur winige wenige (zu wenige !) gut untersuchte Beispiele.

Ziel des Projekts:
Analyse des O-Glykanspektrums verschiedener Schneckenarten und - soweit das technisch möglich ist - eine Lokalisation der jeweiligen Strukturen in den Schnecken und ein Überblick über deren Funktion.

Methodik:
Eine große Herausforderung im Rahmen des Projekts wird die Optimierung der O-Glykananalyse sein. Es gibt viele Methoden um O-Glykane vom Protein frei zu setzen und zu analysieren - allerdings zur Zeit noch keine, die die hier benötigte Empfindlichkeit aufweist !

Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter an diesem Projekt:

Herwig Stepan
Dissertation 2012

Finanzierung

FWF P20393-B11 (03/2008 - 12/2011)

Kooperationspartner

Univ. Prof. Dr. Rudolf Geyer
Justus Liebig Universität Giessen

N-Glykosylierung von Mollusken

Gastropoden werden gegessen, sie richten Schaden in der Landwirtschaft an und dienen in manchen Fällen als Zwischenwirt für Parasiten. Trotzdem ist über diese Organismen noch relativ wenig bekannt.

Es wird nun das Glykosylierungspotential verschiedener Schneckenarten (Nackt - und Gehäuseschnecken, land- und wasserlebende Arten) untersucht.

Einerseits mittels Strukturanalyse der vorhandenen Glykane, andererseits durch Charakterisierung von an der Biosynthese von Glykanen beteiligten Glykosyltransferasen und Glykosidasen.

Vor allem die Fragen ob diese Gastropoden geeignete Expressionssysteme darstellen, ob bekannte kohlenhydrat-basierte Allergene vorkommen und ob über diesen Ansatz eine Schadensbegrenzung in der Landwirtschaft möglich wäre sollten näher untersucht werden.

Mitarbeiter und Mitarbeiterinnen an diesem Projekt:

Heidi Grabher-Meier
Diplomarbeit 1998

Sabine Bürgmayr
Diplomarbeit 1999

Karin Ahrer
Diplomarbeit 2001

Martin Gutternigg
Diplomarbeit 2003

Josef Voglmeir
Diplomarbeit 2006

Judith Rudolf
Diplomarbeit 2007

Sabine Bürgmayr
Dissertation 2000-2003

Finanzierung
FWF 13928 - BIO (04/2000 - 10/2003)

Kooperationspartner

Ass. Prof. Dr. Manfred Pintar
Institut für Zoologie, Department für Integrative Biologie und Biodiversität, BOKU

Reinigung einer Xylosidase aus Kartoffeln

In Pflanzen existieren Xylosidasen, die spezifisch für die β1,2-Bindung von Xylose in N-Glykanen sind. Dieses Enzym wurde mittels biochemischer Reinigungsmethoden aus Kartoffeln gereinigt und charakterisiert (Substratspezifität und biochemische Parameter).

Dieses Enzym eignet sich zum Einsatz in der N-Glykananalytik, wenn bei einem unbekanntem N-Glykan der Verdacht besteht, dass eventuell eine β1,2-xylosylierung vorliegt.

Mitarbeiter und Mitarbeiterinnen an diesem Projekt

Christian Peyer
Diplomarbeit 2000

Kooperationspartner

Prof. Dr. Arnold Stütz
Technische Universität Graz

Prof. Dr. Pedro Bonay
Universidad Autonoma de Madrid

Vergleich von alpha1,6-Fukosyltransferasen

α1,6-Fukosylierung kommt in Säugerzellen am Asparagin-gebundenen N-Acetylglukosamin von N-glykanen vor. Über die, diese Bindung synthetisierenden Enzyme war 1997 noch nicht viel bekannt. Erst ein einziges dieser Enzyme war kloniert (Quelle: Schweinehirn [E.C. 2.4.1.68]) und einige wenige charakterisiert.

In einer Vergleichsstudie wurden α1,6-Fukosyltransferasen aus verschiedenen Geweben (Herz, Lunge, Hirn, Leber) verschiedener Tiere (Rind, Schwein, Schaf, Kaninchen, Huhn) auf ihre biochemischen Parameter hin untersucht und mit den wenigen vorhandenen Literaturdaten verglichen.

Die Enzyme unterschieden sich in ihrem Verhalten, sodass angenommen werden kann, dass es sich auch in diesem Fall um eine Enzymfamilie und nicht ein einziges Enzym handelt. Bei α1,3-Fukosyltransferasen ist so eine die Enzymfamilie bereits gut charakterisiert.

Kenntnisse über die genauen Glykosylierungsfähigkeiten von Zellen sind vor allem dann von Bedeutung wenn diese Zellen, oder auch ganze Organismen, für die Produktion von pharmazeutisch interessanten Glykoproteinen eingesetzt werden sollen.

Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter an diesem Projekt

Sissi Struppe
Diplomarbeit 1997

Kooperationspartner:

Prof. Dr. Wolfgang Wetscherek
Institut für Tierische Lebensmittel, Tierernährung, Ernährungsphysiologie; Department für Lebensmittelwissenschaften und - technologie; BOKU

Finanzierung

FWF 12552-MOB (01/1998 - 12/2000)