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Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2022-04-01 - 2025-09-30

Weiterer Forschungskontext Der Rezeptor für den programmierten Zelltod 1 (PD-1) und sein Ligand, der programmierte Zelltod-Ligand 1 (PD-L1), sind Immun-Checkpoint-Proteine, die das Immunsystem regulieren. Unter physiologischen Bedingungen führt ihr Zusammenspiel zu einer Unterdrückung des T-Zell-Immunsystems. Krebszellen können diesen Weg jedoch umgehen, indem sie PD-L1 exprimieren, um der Immunerkennung zu entgehen. Immuntherapien, die auf die PD-1/PD-L1-Achse abzielen, stellen einen wichtigen Durchbruch in der Krebsbehandlung dar. Mehrere PD-1- und PD-L1-Antikörper sind bereits von der FDA zugelassen. Ihre Wirksamkeit ist jedoch unbeständig und kaum vorhersehbar, weshalb die Entwicklung von PD-1/PD-L1-Inhibitoren, die keine Antikörper sind, vorangetrieben wird. PD-1 und PD-L1 sind stark glykosylierte Proteine, doch die Rolle spezifischer Glykane bei ihrer Interaktion ist nur unzureichend bekannt. Studien über die Auswirkungen der Glykosylierung haben sich auf experimentelle Studien mit Glyko-(Null)-Mutanten konzentriert. Außerdem gibt es keine Berichte über die Auswirkungen der Glykosylierung auf Antikörper, deren Wirkungsweise eine Rezeptorblockade ist und keine ADCC- oder CDC-Aktivität erfordern sollte. Es besteht eindeutig eine Wissenslücke zwischen unserem derzeitigen Verständnis der Immunregulation und der Frage, wie diese manipuliert werden kann, um die klinische Wirksamkeit von Immun-Checkpoint-Blockade-Therapien bei Krebs zu verbessern. Zielsetzung und Methoden Das vorgeschlagene Projekt zielt darauf ab, das System der transienten Expression in N. benthamiana und seine Eignung für das Glyco-Engineering zu nutzen, um Immun-Checkpoint-Proteine und Antikörper mit definierten und homogenen humanähnlichen Glykanen herzustellen. Diese werden verwendet, um den funktionellen Einfluss von Glykanen auf die PD-1/PD-L1-Interaktion zu bestimmen. Darüber hinaus werden die durch Glyco-Engineering hergestellten pflanzlichen Proteine in vitro auf ihre Bindungsaffinität und Effektor-Funktionen untersucht. Wir erwarten, dass wir glykanoptimierte Proteine identifizieren können, die als Lockvogel-/Fangmoleküle fungieren können, um die Bindung von PD-L1 in Tumorzellen an PD-1 in T-Zellen zu hemmen. Grad der Originalität Eine eingehende Analyse der Rolle der Glykosylierung bei PD-L1/PD-1-Wechselwirkungen liegt noch nicht vor. Studien über die funktionelle Aktivität von glykooptimierten Proteinen werden wahrscheinlich wichtige Erkenntnisse über glykanabhängige Wechselwirkungen liefern, die bei therapeutischen Anwendungen in der Krebsbehandlung helfen werden. Diese Forschung stellt einen vielversprechenden neuen und schnellen Weg zur Herstellung und Validierung therapeutischer rekombinanter Proteine dar, der die Zeit bis zum Erreichen bedeutender klinischer und experimenteller Fortschritte in der Krebsimmuntherapie verkürzen kann. Die wichtigsten beteiligten Forscher Alexandra Castilho, die über 27 Jahre Erfahrung in der Molekulargenetik und Zellbiologie und 18 Jahre auf dem Gebiet der pflanzlichen N-Glykosylierung verfügt, wird für die Durchführung des Projekts in enger Zusammenarbeit mit Experten auf den Gebieten Glykoproteomik (Johannes Stadlmann), pflanzliches Molecular Farming (Lukas Mach und Waranyoo Phoolcharoen), Immunologie (Peter Steinberger) und Glykosylierung in der Krebstherapie (Celso Reis) verantwortlich sein.
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2019-06-01 - 2023-05-31

The plant-specific family of arabinogalactan proteins (AGPs) is implicated with a multitude of biological functions and their O-glycan might be crucial for either ligand interactions or for crude biophysical or structural protein properties. In this research proposal, however, I propose a role of O-glycosylation of the AGP type for protein fate by introducing the concept of an O-glycosylation checkpoint. I discuss evidence for the importance of O-glycosylation for protein fate in all eukaryotes and specifically describe the case of the moderately O-glycosylated FASCICLIN-LIKE ARABINOGALACTAN PROTEIN 4 (FLA4) from Arabidopsis thaliana. FLA4 abundance and localization strongly depends on its O-glycosylation. With a set of hydroxyproline-specific galactosyl transferases FLA4 acts in a linear genetic pathway necessary for normal root growth, salt tolerance and seed coat structure. Using FLA4 as genetic paradigm for a functional O-glycoprotein, I suggest hypothetical models of where and how O-glycosylation might influence the fate of plant proteins. I propose experimental approaches to elucidate the genetic and molecular mechanisms that determine the fate of FLA4 in dependence of its O-glycosylation status. Precise definition of proline hydroxylation and -glycosylation as well as molecular identification of crucial modification sites on FLA4, the cell biological elucidation of the involved organelles and the investigation of the degradation mechanism will comprise the first example for an endogenous plant protein that is controlled by its O-glycosylation state. Forward genetic isolation and next generation sequencing-based identification of suppressors of O-glycan dependent control of FLA4 abundance will provide novel genetic components of this process. A remarkable set of signalling proteins that have not previously been considered to be O-glycosylated, potentially also contain this modification. Therefore, it is likely that the O-glycan checkpoint acts on various regulatory pathways. The outcomes of this project will provide an important contribution to our fundamental knowledge of protein glycosylation and proteostasis and might thus contribute to improved stress tolerance of crop plants and the use of plants as factories
Forschungsprojekt aus §26 oder §27 Mitteln
Laufzeit : 2019-05-01 - 2023-10-31

Das Projekt “Untersuchung des ER-Golgi Interface mittels Arabidopsis MNS3” untersucht die Endoplasmatisches Reticulum (ER) alpha-Mannosidase MNS3 aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Dieses Enzym ist Teil der Maschinerie für die Asparagin-(N)-verknüpfte Glykosylierung von Proteinen, welche eine (biologisch) wichtige Proteinmodifikation in Eukaryonten ist und sukzessive im ER und Golgi Apparat abläuft. Das prozessierende Enzym MNS3 generiert eine oligo-mannosidische N-Glykanstruktur, die primär auf ER-residenten Proteinen zu finden ist. Das Enzym selbst sitzt jedoch nicht im ER, sondern befindet sich laut unserer Vorarbeiten in einem Kompartiment des Golgi Apparats, welches dem ER zugewandt und resistent gegen gängige chemische und genetische Mittel ist, die zu einem Zerfall des Golgi Apparats führen. Solch ungewöhnliches Verhalten wurde bis jetzt nur für wenige andere Proteine beobachtet, welche möglicherweise in demselben Golgi-Kompartiment sitzen. Laut unserer Hypothese befindet sich MNS3 zusammen mit diesen Proteinen in einem bis jetzt nicht charakterisierten Membrankompartiment innerhalb des ER-Golgi-Interface, welches funktionell mit dem ER-Golgi-Intermediärkompartiment (ERGIC) der Säuger verwandt sein könnte. Dieses subzelluläre Kompartiment könnte die Proteinsortierung erleichtern und als Gerüst für die Biogenese des Golgi Apparats dienen. Dieses Projekt zielt darauf ab, (1) den exakten Aufenthaltsort von MNS3 innerhalb des bis jetzt wenig charakterisierten ER-Golgi-Interface zu bestimmen, (2) die ungewöhnliche subzelluläre Lokalisation im Golgi mit ihrer biosynthetischen und biologischen Funktion einer ER-typischen Mannosidase in Einklang bringen, und (3) die zu Grunde liegenden Lokalisationsmechanismen zu ermitteln. Wir werden die Modellpflanzen Nicotiana benthamiana und Arabidopsis thaliana einsetzen, um mittels zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die funktionelle Relevanz dieser ungewöhnlichen subzellulären Kompartimentierung in Pflanzen zu beleuchten. Wir erwarten uns, dass die Ergebnisse dieses Projekts Zellbiologen aus den unterschiedlichsten Bereichen dabei helfen, die Mechanismen, welche den Transport von Proteinen entlang des sekretorischen Wegs kontrollieren, besser zu verstehen. Das Wissen um diese Mechanismen und die Regulation der damit im Zusammenhang stehenden biosynthetischen Funktionen in Pflanzen ist deshalb so wichtig, da Pflanzen in biotechnologischer und industrieller Hinsicht ein großes Potential bergen, z.B. bei der Produktion von pharmazeutisch wichtigen Proteinen (z.B. Antikörpern), welche meist stark N-glykosyliert sind und den sekretorischen Weg durchwandern.

Betreute Hochschulschriften